Apoptosi
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Apoptosi

Meccanismi, via intrinseca o morte via mitocondriale, fisiologica e del muscolo scheletrico.

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Apoptosi

Il termine "Apoptosi" è stato usato per la prima volta da Kerr et al. nel 1972 per descrivere una forma di morte cellulare morfologicamente distinta dalla necrosi. L'apoptosi è stata da allora riconosciuta e considerata come un processo di morte cellulare geneticamente programmata, con caratteristiche morfologiche distinte e meccanismi biochimici energia-dipendenti (Ranger et al., 2001). Essa coinvolge l'attivazione controllata di proteasi e altre idrolasi che rapidamente degradano tutte le strutture cellulari; tale degradazione si verifica all'interno della membrana plasmatica intatta, senza che vengano intaccate le cellule vicine. L'apoptosi, quindi, è un processo ben distinto dalla necrosi, in cui la morte cellulare avviene attraverso un meccanismo non controllato, caratterizzato da rigonfiamenti cellulari irreversibili con successiva rottura della membrana plasmatica e fuoriuscita del materiale citosolico nell'ambiente extracellulare, che determina una risposta infiammatoria. Si ritiene che la natura e l'entità del danno indirizzino le cellule verso uno o l'altro meccanismo di morte cellulare. L'apoptosi gioca un ruolo importante nello sviluppo embrionale e nell'invecchiamento dell'organismo ed è considerata una componente vitale in diversi processi fisiologici, inclusi il normale turnover cellulare, l'appropriato sviluppo e funzionamento del sistema immune, l'atrofia ormone-dipendente (Kroemer G et al., 2007; Pollack M et al., 2002). L'apoptosi oltre che come meccanismo omeostatico per mantenere in vita le cellule nei tessuti, funge anche come meccanismo di difesa verso le cellule danneggiate da malattia o da agenti tossici (Norbury and Hickson, 2001). Bisogna anche precisare che, nonostante ci sia una ampia varietà di stimoli o condizioni -sia fisiologiche che patologiche- che possono indurre apoptosi, questa non si verifica in tutte le cellule, come a dire le cellule muoiono a seguito di stimoli diversi. Un'attività apoptotica equilibrata è importante per "il benessere" della cellula e dell'organiamo. Un' apoptosi inappropriata, sia in eccesso che in difetto, è stata rilevata in diverse condizioni patologiche umane che includono i tumori, le malattie neurodegenerative, il danno ischemico e i disordini autoimmuni. L'abilità di modulare la vita o la morte di una cellula è riconosciuto anche per il suo immenso potenziale terapeutico. Pertanto, la ricerca continua a focalizzarsi sulla comprensione e l'analisi dei meccanismi del ciclo cellulare e dei segnali che controllano l'arresto del ciclo cellulare e l'apoptosi. Molte delle proteine chiave dell'apoptosi sono state identificate, ma i meccanismi molecolari di attivazione o inattivazione di queste proteine sono ancora oggetto di studio.

I meccanismi dell'apoptosi

I meccanismi dell'apoptosi sono altamente complessi e sofisticati, coinvolgendo una cascata di eventi molecolari energia-dipendenti, mostrati nella figura 12.

apoptosi
Figura 12. Rappresentazione schematica degli eventi apoptotici . Le due principali vie dell'apoptosi sono quella estrinseca e quella intrinseca e la via perforin/granzyme. Ognuna richiede specifici segnali di induzione per iniziare una cascata energia-dipendente di eventi molecolari. Ogni via attiva le proprie caspasi attivatrici che a loro volta attiveranno le caspase-3 esecutrici. Tuttavia, granzyme A lavora in una maniera caspase-indipendente. La via di esecuzione risulta in lineamenti morfologici caratteristici che includono contrazione cellulare, condensazione della cromatina, formazione di vescicole citoplasmatiche e corpi apoptotici per finire con la fagocitosi dei corpi apoptotici di tramite delle cellule parenchimali adiacenti, delle cellule neoplastiche o dei macrofagi (da Elmore S, 2007).

Attualmente è noto che le principali vie che possono dare luogo al manifestarsi di fenomeni apoptotici nei mammiferi, sono due. Entrambe, che saranno analizzate nel dettaglio successivamente, sono controllate da enzimi appartenenti alla famiglia della Caspasi. Questi enzimi denominati caspasi sono una famiglia di proteasi aventi nel sito attivo la cisteina, che si differenziano dalle altre per essere aspartato-specifiche; agiscono cioè, sulle proteine bersaglio tagliandole a livello dei residui di aspartato.

Le caspasi sono sintetizzate all'interno della cellula come precursori inattivi (chiamati Procaspasi) per poi essere attivate mediante processo proteolitico. Possono essere suddivise in due categorie in base all'effetto svolto :

  • Pro-infiammatorie (caspasi 1, 4, 5, 11, 12, 13, e 14)
  • Pro-apoptotiche: questa categoria si suddivide a sua volta in: - Caspasi iniziatrici (caspasi 2, 8, 9, e 10) - Caspasi effettrici (caspasi 3, 6, e 7)

La promozione in forma attiva delle caspasi iniziatrici da avvio ad un processo irreversibile che consiste nell'attivazione, mediante una cascata proteolitica, delle altre caspasi, conducendo la cellula alla morte programmata o apoptosi appunto.Questo processo può svolgersi, come anticipato in precedenza, mediante due differenti vie:

La via estrinseca o morte via recettoriale:

Può essere innescata da un segnale mediato dal legame di un ligando extracellulare ad un recettore trans membrana che porta alla formazione di un complesso DISC (Death-Inducing Signalling Complex) in grado di attivare la procaspasi 8; a differenza della via intrinseca, dipende quindi, da fattori esterni che operano attraverso recettori situati sulla membrana plasmatica, i quali si differenziano a seconda del tipo di ligando. I principali sono:

TNF-R1 e TNF-R2

Su questi recettori interagisce il ligando TNF (Tumor Necrosis Factor), una citochina pro-infiammatoria prodotta principalmente dai macrofagi e coinvolta in numerose patologie come malattie autoimmuni, tumori e malattie neurodegenerative. Il recettore TNF-R1 è indifferentemente espresso nei vari tessuti, mentre il TNF-R2 si trova principalmente nel sistema immunitario.

FAS (CD95)

A questo recettore si lega una molecola di superficie cellulare che appartiene alla famiglia dei TNF, la Fas Ligand. L'interazione ligando-recettore porta appunto alla formazione del complesso DISC (Death-Inducing Signaling Complex), responsabile della segnalazione di morte cellulare. DISC presenta la proteina FADD (Fas-Associated Death Domain) la quale, attraverso il suo dominio effettore di morte DED (Dead Effector Domain), va a reclutare molte molecole di pro-caspasi 8 legandole al complesso CD95/FADD. A seguito di questo evento si ha l'attuazione di un processo auto-proteolitico a carico delle pro-caspasi 8, determinandone l'attivazione.

TRAIL (Apo 2)

A questa via appartengono 5 tipologie di recettori sui quali si va a legare la molecola TRAIL, una proteina affine ai restanti membri della superfamiglia di TNF . Diversi studi hanno mostrato come TRAIL sia un potente induttore dell'apoptosi in un'ampia gamma di linee cellulari. TRAIL può legarsi a 5 tipologie di recettori che si differenziano in 2 categorie:

Recettori che inducono ipoptosi, cioè TRAIL R1 – TRAIL R2 (DR5) che presentano nella porzione terminale un dominio di morte, capace di regolare l'attivazione della caspasi e portare infine ad apoptosi.

Recettori che inibiascono apoptosi, cioè TRAIL R3 – TRAIL R4 (DR2) – osteoprotegerina, in cui manca la funzionalità del dominio di morte. In particolar modo in DR2 il dominio è troncato mentre in DR1 manca completamente. Entrambi i recettori sono quindi incapaci di trasmettere il segnale di apoptosi.

La via intrinseca o morte via mitocondriale:

Viene innescata in seguito a segnali di stress che causano il rilascio di fattori mitocondriali come il citocromo c, che oligomerizza e porta alla formazione di un complesso di segnalazione, l'apoptosoma, che attiva la procapasi 9. Ma può essere attivata anche da segnali intracellulari quali danni al DNA, stress ossidativo, ipossia , segnali oncogeni o mancanza di fattori di crescita.

Più nel dettaglio, questi fattori agiscono su una famiglia di proteine Bcl-2 (B-cell Lymphoma 2) capaci di regolare la permeabilità della membrana mitocondriale esterna.

Di questa famiglia fanno parte sia proteine pro-apoptotiche che anti-apoptotiche. Le prime si suddividono in proteine multi dominio (Bax, Bak, Bok) e proteine BH3-only (Bim, Bid, Bad, Bik, Bmf, Hrk, Puma, Noxa, ecc) e favoriscono l'apoptosi.

Le anti-apoptotiche (tra cui Bcl-2, Bcl-XL, Mcl-l, Bcl-W, Bfl-l e Bcl-B) promuovono invece la sopravvivenza cellulare. Quando i segnali di sopravvivenza prevalgono su quelli di morte le proteine pro-apoptotiche (Bax, Bak) vengono legate e inibite da quelle anti-apoptotiche (Bcl-2, Bcl-XL, Bcl-W). Qualora invece prevalgano i segnali di morte, le proteine pro-apoptosi BH3-only vanno ad attivare Bax e Bak, le quali agiscono sulla membrana mitocondriale esterna, aumentandone la permeabilità . Ciò comporta il rilascio nel citoplasma di fattori apoptogeni solubili come il citocromo C e la proteina mitocondriale SMAC/DIABLO. La maggior parte del citocromo C è localizzato nel foglietto esterno della membrana mitocondriale interna e interferisce con la catena di trasporto degli elettroni.

L'ossidazione della cardiolipina, permette al citocromo C di riversarsi nello spazio intermembrana e, successivamente, nel citosol grazie alla permeabilità della membrana mitocondriale esterna. Nel citosol il citocromo C va a stimolare la formazione dell'apoptosoma, un complesso multi-proteico formato da Apaf-1 (Apoptotic protease-activating factor 1) – dATP – citocromo e procaspasi 9. Quest'ultima subisce poi una proteolisi, passando alla forma attiva caspasi 9, capace di innescare le caspasi effetrici 3-6-7. La caspasi-3, in particolare, viene fisicamente reclutata sull'apoptosoma.

Allo stesso tempo la proteina SMAC/DIABLO rilasciata nel citosol va a legarsi con IAP (proteina inibitrice dell'apoptosi), responsabile, in condizione cellulari fisiologiche, dell'inibizione della cascata apoptotica. Il pathway mitocondriale può essere anche attivato da meccanismi caspasi - indipendenti, che coinvolgono il rilascio dai mitocondri e la traslocazione nel nucleo di due proteine: il fattore che induce l'apoptosi (Apoptosis Inducing Factor - AIF) e l'Endonucleasi G.

Inoltre la via intrinseca può essere attivata in seguito a danno irreversibile al DNA, come già anticipato: in questo caso la cellula muore per apoptosi, sotto il controllo della proteina p53, considerata comunemente un "tumor-suppressor". La proteina p53 risponde a diversi stress cellulari determinando l'arresto del ciclo cellulare nella fase G1.

Studi recenti documentano che le due vie sono legate e che le molecole di una via possono influenzare l'altra (Elmore S, 2007). Esiste, inoltre, una via addizionale che coinvolge la citotossicità mediata dalle cellule T e la morte delle cellule perforin-granzyme-dipendente. La via perforin-granzyme può indurre apoptosi attraverso sia granzyme B o granzyme A. La via granzyme A attiva una via di morte cellulare parallela, caspase indipendente, attraverso un singolo danneggiamento del DNA coinvolto. Le vie estrinseca, intrinseca e granzyme B convergono sulla stessa via finale o d'esecuzione, che inizia dalla cascata di caspace3 e risulta in una frammentazione del DNA, nella degradazione del citoscheletro e delle proteine del nucleo, nella reticolazione di proteine e formazione di corpi apoptotici, vche vengono fagocitati dai macrofagi e degradate nei fagolisosomi. Non vi è alcuna reazione infiammatoria associata al processo apoptotico o alla rimozione delle cellule apoptotiche perché:

  • le cellule apoptotiche non rilasciano i loro costituenti cellulari nel tessuto interstiziale circostante
  • sono rapidamente fagocitati dalle cellule circostanti prevenendo così probabili necrosi secondarie
  • le cellule che inglobano non producono citochine antiinfiammatorie (Elmore S, 2007).

L'apoptosi fisiologica

Il ruolo fisiologico dell'apoptosi è tanto importante quanto la sua controparte, la mitosi. L'apoptosi, infatti, esercita un ruolo complementare ed opposto alla mitosi e alla proliferazione cellulare nella regolazione di varie popolazioni cellulari. È stato stimato che per mantenere l'omeostasi nel corpo umano adulto, ogni giorno vengono prodotte circa 10bilioni di cellule, fino a bilanciare quelle distrutte dall'apoptosi (Renehan et al., 2001). Questo numero può aumentare in maniera significativa quando si richiede un aumento dell'apoptosi ad esempio durante il normale sviluppo o invecchiamento dell'organismo o durante una malattia.

L'apoptosi ha un ruolo molto critico nei processi di sviluppo. A titolo di esempio, si ricorda che sia il sistema nervoso che il sistema immune maturano attraverso una overproduzione di cellule. A questa iniziale overproduzione segue la morte delle cellule che falliscono nello stabilire, rispettivamente, connessioni sinaptiche funzionali o produttive specificità antigeniche (Opferman and Korsmeyer, 2003). L'apoptosi è anche necessaria per liberare il corpo da cellule infettate da agenti patogeni ed è una componente vitale per la guarigione delle ferite, in quanto è coinvolta nella rimozione delle cellule infiammate e nello sviluppo del tessuto di granulazione all'interno delle cicatrici (Greenhalgh, 1998). Un non adeguanto funzionamento dell'apoptosi durante la guarigione della ferita può condurre a forme patologiche come ad un'eccessiva cicatrizzazione e fibrosi. L'apoptosi è anche necessaria per eliminare cellule immuni attivate o auto aggressive durante la maturazione sia negli organi linfoidi centrali (midollo spinale e timo) che nei tessuti periferici. In aggiunta, l'apoptosi è centrale nei processi di rimodellamento nell'adulto come, per citare due esempi, nell'atresia follicolare del follicolo post-ovulatorio e nell'involuzione della ghiandola mammaria post-svezzamento (Lund et al., 1996). Inoltre, come gli organismi invecchiano, alcune cellule cominciano a deteriorare a una velocità maggiore e sono eliminate via apoptosi. Una teoria è che lo stress ossidativo gioca un ruolo primario nella patofisiologia dell'apoptosi età-indotta a seguito del danno da radicali liberi accumulato a livello del DNA mitocondriale (Ozawa, 1995). È chiaro che l'apoptosi deve essere ben regolata dal momento che una morte o eccessiva o ridotta delle cellule può condurre a malattia, includendo difetti nello sviluppo, malattie autoimmuni, neurodegenerazione e cancro.

L'apoptosi nel muscolo scheletrico

La deregolazione dell'apoptosi è considerato un meccanismo patogenetico alla base di numerose patologie. Il significato dell'apoptosi è ben riconosciuto nella patologia tumorale. Il suo ruolo nelle patologie di tessuti post-mitotici, ed in particolar modo dei muscoli, è ancora oggetto di discussione, nonostante i primi studi sull'apoptosi derivano da ricerche sullo sviluppo dei muscoli delle larve (Lockshin et Williams, 1965). Il muscolo è un tessuto molto peculiare in quanto le miofibre sono caratterizzate dalla presenza di segmenti citoplasmatici regolati ognuno da singoli mionuclei. In presenza di stimoli apoptotici i nuclei della fibra muscolare vanno incontro ad apoptosi non tutti simultaneamente, ma secondo una eliminazione progressiva che determina una successiva degenerazione del segmento citoplasmatico. Questo fenomeno, a lungo termine ai processi di atrofia e degenerazione muscolare presenti in diverse condizioni patologiche (Dupont-Versteegden, 2006).

Le distrofie muscolari sono, da sempre, state considerate degli esempi caratteristici di perdita di fibre muscolari mediante processi di necrosi. Tuttavia, nelle fibre muscolari del topo mdx è stato chiaramente dimostrato che l'apoptosi precede la necrosi (Tidball et al.; 1995). Inoltre, la morte cellulare programmata, appunto l'apoptosi, appare coinvolta anche in altri tipi di patologie a carico del muscolo scheletrico, come le atrofie, le miopatie infiammatorie, la denervazione, il disuso e l'atrofia muscolare spinale (Sandri e Carraro, 1999). Non vi sono dati definitivi sul coinvolgimento dell'apoptosi nelle distrofinopatie, anzi il suo ruolo risulta ancora controverso. Studi recenti, però, hanno dimostrato che una eccessiva apoptosi di mionuclei dovuta a disfunzione latente a carico dei mitocondri delle cellule muscolari, ha un ruolo cruciale nel meccanismo patofisiologico delle distrofie legate al ColVI (Angelin et al., 2007).