Autofagia nel muscolo
NonSoloFitness: divulgazione, formazione, consulenza
Corsi di formazione Corsi di formazione per Personal Trainer, Istruttori Fitness
06 40403925

Autofagia nel muscolo

La macroautofagia, materiali e metodi, Rna, estrazione delle proteine, protocollo di esercizio.

Autore:
Ultimo aggiornamento:

Autofagia nel muscolo

L'esercizio influenza l'omeostasi della cellula muscolare modificando l'ambiente intra- ed extracellulare, compromettendo lo stato energetico e allungando le membrane. Questi fattori di stress conducono ad un rimodellamento del muscolo attraverso eventi di trascrizione e di trasduzione finalizzati a far fronte ad ulteriori modifiche dell'omeostasi cellulare indotte dall'esercizio. Questi aggiustamenti danno luogo agli effetti benefici dell'esercizio per la salute e migliorano anche le prestazioni sportive. Tuttavia, il rimodellamento implica che la degradazione delle proteine sia, almeno transitoriamente, attivata. Alcuni sistemi enzimatici sono coinvolti nella degradazione delle proteine muscolari. Accanto al ruolo delle calpaine, caspasi e metallo proteine, l'attivazione del sistema ubiquitin-proteasoma nel muscolo scheletrico durante esercizi di resistenza (endurance exercise) è stato oggetto di particolare attenzione negli ultimi anni (Jamart C, et al., 2012; Kim HJ, et al., 2011). Più recentemente è stato dimostrato che anche l'esercizio di endurance è uno stimolo che induce l'autofagia nei tessuti (Grumati P, et al., 2011; He C, et al. 2012; Jamart C, et al., 2012; Lira VA, et al., 2013).

La macroautofagia -qui chiamata autofagia- è un processo catabolico cellulare che fornisce costituenti cellulari, incapsulati all'interno di vescicole a doppia membrana chiamate autofagosomi (AP), ai lisosomi, i quali provvedono alla loro degradazione. L'autofagia può processare numerosi costituenti cellulari, incluse le proteine solubili, gli aggregati proteici e i mitocondri (Bechet D, et al., 2005; Kirkin V, et al., 2009). L'identificazione nei mammiferi dei geni dell'autofagia e delle proteine ad essa correlate (Atg) ha permesso di comprendere i meccanismi molecolari responsabili per la formazione dell'autofagosoma (AP) (Klionsky DJ, 2007).

L'autofagia inizialmente era considerata un processo non selettivo di degradazione della massa. Attualmente sono disponibili evidenze che documentano che l'autofagia può avere, come bersaglio aggregati di proteine e organelli, ed è quindi un processo del tutto selettivo. Per la rimozione selettiva di specifici substrati è noto che sono richieste alcune proteine, incluso il p62/sequestosoma1 (SQSTM1) (Pankiv S, et al., 2007). La Mitofagia si riferisce alla degradazione selettiva dei mitocondri attraverso l'autofagia ed è necessaria per mantenere una sana rete mitocondriale, attraverso l'eliminazione selettiva di mitocondri vecchi e/o danneggiati (Youle RJ and van del Bliek AM, 2007). Le reti mitocondriali sono dinamiche e sono governate da processi di fusione e di scissione. Questi processi permettono alla cellula di possedere una rete mitocondriale interconnessa e continuamente rinnovata. Sembra inoltre che, un aumento dei processi di scissione mitocondriale, preceda la mitofagia (Youle RJ and van del Bliek AM, 2007).

L'autofagia, nel muscolo scheletrico, è attivata da numerosi stimoli catabolici come la privazione di cibo, la denervazione e la sepsi (Mammucari C et al., 2007; Mofarrahi M, et al.,2012; Zhao J, et al., 2007). Tuttavia, l'evidenza della necessità di un livello basale di autofagia per mantenere l'integrità delle miofibrille è stata contrastata dalla visione di un sistema coinvolto solo nell'atrofia muscolare (Masiero E, et al., 2009). Molto recentemente è emerso che l'attivazione del sistema autofagia-lisosoma è un processo essenziale per l'adattamento del muscolo scheletrico dopo l'esecuzione di esercizi di endurance (endurance training) (Lira VA, et al., 2013). Pertanto, è sembrato importante studiare le condizioni fisiologiche dell'esercizio durante il quale l'attivazione dell'autofagia è ottimizzata. Gli autori di questo lavoro preso in considerazione come caso studio (Jamart C et al., Am J Physiol Endocrinol Metab, August 20, 2013 (in press)) hanno ipotizzato che l'autofagia sia attivata in misura maggiore quando l'esercizio di endurance è effettuato in una condizione di digiuno piuttosto che in una condizione di sazietà. A tal proposito, e costituisce l'obiettivo secondario dello studio, gli autori si propongono di spiegare i meccanismi molecolari sottostanti la regolazione dell'autofagia indotta da esercizio nelle sopramenzionate condizioni nutrizionali (digiuno e sazietà).

Materiali e metodi

Animal care e gruppi di topi. Trentasei topi C57BL6 femmine (di 12 settimane ) sono state fornite dalla Jansen (Le Genest-Saint-Isle, France). Gli animali erano alloggiati a 22°C con un ciclo di 14 ore di luce (dalle 7 alle 21) e 10 ore di buio, e con libero accesso al cibo e all'acqua. Tutte le procedure erano approvate dal Comitato Etico per le pratiche sugli animali da esperimento dell'Università cattolica di Louvain. Le condizioni di alloggio erano in accordo con la legge Belga del 6 Aprile 2010 sulla protezione degli animali di laboratorio. Gli animali sono stati divisi in 4 gruppi (n=9 topi per gruppo) in accordo con la condizione nutrizionale e l'esercizio: gruppo 1) Sazietà+Riposo (Fed+Rest); gruppo 2) Sazietà+Esercizio (Fed+Run); gruppo 3) Digiuno+Riposo (Fasted+Rest); gruppo 4)Digiuno+Esercizio (Fasted+Run).

Protocollo di esercizio. Gli animali hanno effettuato tre esercizi preliminari di avvicinamento con velocità 8metri/min per 10 minuti per familiarizzare con il tapis roulant in movimento. L'intervallo tra due sessioni di familiarizzazione era di almeno due giorni e l'ultima sessione di familiarizzazione era organizzata tre giorni prima dell'esperimento. Il giorno dell'esperimento, i gruppi esercitati hanno corso per 90 minuti alla velocità di 10m/minuto, che corrisponde alla intensità minima per questa specie di topi (circa 55% di VO2max) (Zbinden-Foncea H, et al., 2012). Si è scelto la durata di 90 minuti perché studi precedenti hanno dimostrato che, nei differenti gruppi di muscolo scheletrico dei topi sottoposti ad esercitare la corsa, a questa durata si verifica una fase di plateau- es. nessun ulteriore aumento- nell'accumulo del numero di autofagosomi (He C, et al., 2012), per cui è stata ritenuta ottimale. Ai gruppi a digiuno era impedito l'accesso al cibo alle 23,30, durante il ciclo di buio. I topi del gruppo Digiuno+Corsa hanno iniziato l'esercizio dopo 8 ore dalla privazione di cibo.

Sacrificio e raccolta dei campioni. Ai topi è stata somministrata un'iniezione intraperitoneale di una dose letale di un mix di ketamina (200mg/kg) e xilazina (20mg/kg). La profondità dell'anestesia era cercata dall'assenza di riflessi della palpebra e delle zampe. Gli animali esercitati erano sacrificati immediatamente dopo aver completato l'esercizio. I topi a digiuno erano sacrificati dopo 9.5 ore dall'eliminazione del cibo. I muscoli gastrici di destra e sinistra erano escissi, asciugati e immediatamente congelati in nitrogeno liquido. Il sangue venoso era raccolto dalla vena cava inferiore usando una siringa 26G e conservato in ghiaccio in un tubo EDTA fino alla centrifugazione. I campioni di plasma erano raccolti dopo centrifugazione a 10.000g per 5 minuti. Tutti i campioni erano conservati a -80°C prima di ulteriori analisi.

Concentrazione plasmatica dell'insulina. La concentrazione di insulina nel plasma era determinata dall'ELISA test, usando il kit ultrasensibile all'insulina di topo fornito da Mercodia (Uppsala, Svezia) e seguendo le istruzioni del produttore. Brevemente, 25µl di plasma di ogni campione erano messi su una piastra rivestita di anticorpo monoclonale anti-insulina di topo. 100µl di anticorpo monoclonale anti-insulina di topo perossidasi-coniugato era aggiunto e, agitando delicatamente, incubato per 2 ore a temperatura ambiente. Successivamente, i tubi sono stati lavati per 6 volte per eliminare gli anticorpi non coniugati. Gli anticorpi coniugati sono stati misurati facendoli reagire con un substrato di 200µl di tetrametilbenzidina (TMB). Dopo 15 minuti di incubazione con TMB, sono stati aggiunti 50µl di una soluzione di arresto contenente 0.5M di acido solforico (H2SO4). La piastra è stata agitata per 5s prima di leggere l'assorbimento a 450nm. I campioni sono stati valutati in duplicato e la concentrazione è stata determinata sulla base dei calibratori del kit.

Estrazione delle proteine. I muscoli sono stati schiacciati in nitrogeno liquido usando mortaio e pestello. I muscoli polverizzati sono stati omogeneizzati in ghiaccio secco contenente 20mM, pH7.0, di Tris, 270mM di saccarosio, 5mM di EGTA, 1mM di EDTA, 1% di Tritob X-100, 1mM sodio ortovanadato, 50mM di ß-sodioglicerofosfato, 5mM di sodio pirofosfonato, 50mM di fluoruro di sodio, 1mM di DDT (1,4-ditiotreitolo) e un cocktail inibitore della proteasi contenente 1mM di EDTA. Dopo incubazione in ghiaccio per 5 minuti, gli omogenati sono stati centrifugati per 10minuti a 10.000g, 4°C. I supernatanti sono stati immagazzinati a -80°C. Il contenuto in proteine è stato determinato usando il kit per l'analisi proteica DC (Bio-Rad, Nazareth Eke, Belgium) usando il siero di albumina bovina come standard.

SDS-PAGE e immunoblotting. Le proteine (20-40µg) sono state mescolate con un tampone campione Laemmli. Per le misure dei carbonili proteici, 10µg di proteine sono state derivatizzate con 2,4-dinitrofenilidrazina prima dell'elettroforesi, come descritto dal kit di ossidazione delle proteine della Merck Millipore (Billerica, MA, USA). Le proteine sono state separate da SDS-PAGE per 2 ore all'intensità costante di 40mA e trasferite su membrane PVDF a 80V per 2.5 ore. Dopo un blocco per 1 ora in 0.1% Tween 20 Tris-buffered saline (TBST) e 5% di latte secco non grasso, le membrane sono state incubate per tutta la notte a 4°C con uno dei seguenti anticorpi primari: dinitrofenil (Sigma Aldrich, Diegen; Belgio), fosfo-AktSer473, fosfo-AktThr308, Akt, fosfo-5'-AMP-attivato protein kinasi alphaTh172 (AMPKaTh172), AMPKa, Atg4b, Atg12, Beclin-1, fosfo-dinamin-correlate protein1Ser616(DRP1 Ser616), DRP1, fosfo-factor4E legante proteina1Thr37/46 (4E-BP1Thr37/46), 4E-BP1, eukaryotic elongation factor2 (eEF2), fosfo-eukaryotic initiation factor2 alphaSer51 (eIF2aSer51), eIF2a, fosfo-Forkhead box contenente O-sublass3aThr32 (FoxO3aThr32), FoxO3a, microtubule-associato protein1 light chain3b (LC3b), fosfo-p38Thr180/Tyr182, p38 (non specifico di una determinata isoforma), foso-p70-ribosomal s6 kinasiThr389 (S6K1Thr289), fosfo-UNC-51-like kinasi1 (ULK1)Ser757, ULK1Ser555, ULK1Ser317, ULK1 (Cell Signaling Technology, Leide, Olanada), Bcl-2/E1B-19kD interacting protein3 (BNIP3), ?-aminobutyric acid receptor-associated protein (Gabarap)-like1 (Gabarapl1), Parkin (Abcam, Cambridge, United Kingdom), S6K1 (santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Germania) o p62/SQSTM1 (Progen Biotechnik, Heidelberg, Germania). Le membrane sono state lavate tre volte con TBST e incubate per 1 ora a temperatura ambiente con un anticorpo secondario coniugato a perossidasi di rafano (horseradish peroxidase) (Sigma-Aldrich). Più di tre lavaggi sono stati effettuati prima della individuazione tramite chemiluminescenza con ECL-Plus Western blotting kit (Amersham Biosciences, Diegem, Belgio). Le membrane sono state quindi fotografate con GBox system, usando il software Gene Snap. L'intensità del segnale era addensato usando GeneTool Program. I livelli di espressione sono stati normalizzati a eEF2, la cui espressione è insensibile ai trattamenti. Le proteine fosforilate sono state corrette per le forme totali. Quando non menzionate, le forme totali di fosfo-proteine sono rimaste immodificate in tutte le condizioni sperimentali.

Estrazione di RNA e quantitativo Real-Time PCR. I muscoli sono stati schiacciati in nitrogeno liquido usando mortaio e pestello. I muscoli polverizzati sono stati omogeneizzati in 1ml di Trizolo. L'isolamento del RNA è stato condotto in accordo con le istruzioni del produttore, la qualità e quantità di RNA è stata valutata con lo spettrofotometro Nanodrop. La trascrizione inversa è stata ottenuta da 1µg di RNA usando iScriptTMcDNA Synthesis kit ottenuto da bio-Rad, in accordo alle istruzioni del produttore. I primers usati per PCR quantitativo sono elencati nella Tavola 1. Gli esprimenti sono stati condotti con il termociclatore MyIQ2, alle seguenti condizioni: 3min a 95°C, seguiti da 35 cicli di 30s a 95°C, 30s a 60°C e 30s a 72°C. Per ogni gene, tutti i campioni sono stati gestiti in duplicato sulla stessa piastra. Ogni reazione è stata processata in un volume di 10µl contenente 4.8 IQ SybrGreen SuperMix (Bio-rad), 0,1 µl di ogni primer (100nM finali) e 5µl cDNA della diluizione appropriata. Le curve di fusione sono state sistematicamente valutate per il controllo di qualità. I relativi livelli di espressione di mRNA sono stati normalizzati a proteina ribosomiale L19 (ROL19), la cui espressione non era sensibile ai trattamenti.

Analisi statistica. I valori sono riportati nelle figure come medie±ES (Errore Standard della media). Il test ANOVA a due vie è stato eseguito per valutare la significatività statistica. E' stato applicato il test Bonferroni post-hoc. Dal momento che la concentrazione plasmatica era al di sotto della soglia di detenzione in qualsiasi animale nella condizione di digiuno, è stato usato un rank test non parametrico. La significatività statistica era considerata per p0.05.