Autofagia
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Autofagia

I meccanismi, autofagia fisiologica, autofagia nel muscolo scheletrico.

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Autofagia

L'autofagia (dal greco: 'auto' senso di sé e 'phagein' significato mangiare) è il processo mediante il quale componenti della cellula vengono consegnati ai lisosomi per la loro degradazione.

È un processo omeostatico che avviene in tutte le cellule eucariote e costituisce un importante meccanismo nel turnover cellulare per eliminare organelli danneggiati, patogeni intracellulari, porzioni superflue di citoplasma e aggregati proteici anomali. L'autofagia è considerata la principale via inducibile per il turnover generale dei componenti del citoplasma ed è stato dimostrato che in alcune condizioni fisiologiche o di stress la sua attivazione risulta vantaggiosa per l'organismo. Alla luce di queste osservazioni è stato ipotizzato che l'autofagia rappresenti un importante meccanismo di adattamento che cerca di salvare le cellule dalla morte. In altre parole, la presenza di vescicole autofagiche nelle cellule morenti può riflettere una risposta adattativa di sopravvivenza cellulare in condizioni di stress, piuttosto che un riflesso della "morte cellulare autofagica". Attualmente è riconosciuto che l'autofagia è ampiamente implicata nei processi patofisiologici (es. cancro, disordini metabolici e degenerativi, malattie polmonari e cardiovascolari) e nella risposta fisiologica all'esercizio e all'invecchiamento (Choi AMK et a,l, 2013). È stato anche sviluppata l'ipotesi che l'autofagia rappresenti un altro meccanismo di morte cellulare programmata che, come l'apoptosi, abbia un ruolo sia in condizioni fisiologiche che patologiche (Gozuacik and Kimchi, 2004; Debnath et al., 2005). La morte cellulare per autofagia, benché anch'essa regolata geneticamente, è morfologicamente diversa dall'apoptosi e prevede una riorganizzazione dinamica delle membrane subcellulari per regolare la degradazione di componenti citoplasmatici. In un certo senso, la cellula "cannibalizza" se stessa. Inoltre, si stanno accumulando evidenze che le cellule autofagiche possono suicidarsi per far fronte a un eccessivo stress, che differisce in qualche modo dall'apoptosi e dalla necrosi cellulare (Bialik S et al., 2010; Eisenberg-Lerner A et al. 2009). Il processo dell'autofagia dipende sia dalla continua sintesi delle proteine sia dalla continua presenza di ATP. Alla regolazione del processo autofagico partecipano varie chinasi, fosfatasi e guanosintrifosfatasi, ma i dettagli molecolari dell'autofagia, non sono completamente noti e sono ancora oggetto di studio e ricerca (Elmore S, 2007).

I meccanismo dell'autofagia

In generale, il processo dell'autofagia può essere diviso in 4 passaggi: (1)induzione, (2) formazione dell'autofagosoma, (3) fusione con il lisosoma o vacuolo, (4)ripartizione del corpo autofagico e riciclaggio (Figura 2). Nei mammiferi sono stati descritti tre differenti meccanismi autofagici: macroautofagia, autofagia chaperone-mediata (CMA) e microautofagia.

microautofagia
Figura 14. Macroautofagia, microautofagia e autofagia chaperone-mediata (CMA): Macroautofagia (maggioritaria); Microautofagia (invaginazioni membrana lisosomiale o endosomi tardivi); Autofagia mediata da proteine chaperone (non implica riorganizzazione di membrane ma l'intervento di specifiche proteine citosoliche)

La macroautofagia (comunemente detta autofagia) è la forma più studiata, e consiste in un processo di degradazione, mediante il quale la cellula elimina o ricicla organelli superflui o danneggiati e proteine, attraverso la costituzione di un autofagosoma; la microautofagia, determina l'eliminazione di piccole porzioni di citoplasma che vengono avvolte direttamente dalla stessa membrana lisosomale a; l'autofagia chaperon-mediata (CMA) compie una degradazione di tipo selettivo: proteine contenenti particolari sequenze sono riconosciute da chaperones citosolici e trasportate nel compartimento lisosomale (Mizushima, 2004).

Attualmente i dati relativi al processo autofagico nel muscolo si riferiscono alla macroautofagia, anche se si stanno accumulando dati che sembrano documentare, anche per microautofagia e la CMA, un effettivo coinvolgimento nell'omeostasi o atrofia muscolare. Nella macroautofagia, porzioni di citosol e organelli completi sono inghiottiti da strutture a doppia membrana chiamati autofagosomi o primi vacuoli autofagici (AV-I). La formazione dell'autofagosoma comincia da una struttura pre-autofagosomale che si ritiene si origini dal reticolo endoplasmatico, detta fagoforo o membrana d'isolamento; questa si estende da entrambi i lati e si richiude attorno al target da eliminare, dando luogo all'autofagosoma. Successivamente avviene la fusione dell'autofagosoma con il lisosoma, a formare una vescicola dotata di una sola membrana detta auto lisosoma o vacuolo autofagico finale (AV-II). La membrana esterna dell'autofagosoma, quindi, si fonde con la membrana lisosomale mentre il sacco interno (corpo autofagico) penetra nel lisosoma e viene degradato insieme alla membrana interna grazie alle idrolasi del compartimento litico. Gli elementi risultanti dal contenuto luminale degradato vengono restituiti al citosol per le reazioni metaboliche (Ferraro e Cecconi, 2007; Levine e Kroemer 2008).

La regolamentazione della formazione dell'autofagosoma è complessa (Mizushima N et al, 2008; Sandri M, 2010) e il suo principale regolatore negativo è mTOR, una serintreonin chinasi, che consente in condizioni fisiologiche la formazione dell'autofagosoma. mTOR spesso è descritta come un sensore della disponibilità di nutrienti. In mancanza di nutrienti, infatti, mTOR viene inibita e si innesca la macroautofagia, attraverso l'attivazione enzimatica di un complesso multiproteico regolatorio (contenente formato Vps34, Beclin 1, Vps15, Ambral e Atg14) che determina il reclutamento di LC3 al nascente autofagosoma. La forma attiva citosolica di LC3 (LC3I) viene modificata nella forma LC3-II che interagisce e si coniuga con la fosfatidiletanolammina. Questa coniugazione induce una modificazione conformazionale in LC3 che è essenziale per il suo legame alla membrana di pre-autofagosomi, autofagosomi, e corpi autofagici. Il complesso LC3-fosfatidil-etanolammina posto sull'esterno della membrana è rimosso prima della fusione con i lisosomi, mentre quello localizzato all'interno della membrana rimane rilevabile fino alla degradazione da parte delle idrolasi. LC3 è attualmente considerato l'unico marcatore affidabile per la formazione dell'autofagosoma nelle cellule di mammifero (Ferraro E and Cecconi F, 2007; Sandri M, 2010).

L'autofagia fisiologica

Come il "ruolo di Giano", l'autofagia controlla una miriade di processi fisiologici inclusi il digiuno, la differenziazione cellulare, la sopravvivenza e la morte cellulare (Liu B, et al.,2010). L'autofagia agisce come un meccanismo di sopravvivenza sotto condizioni di stress, mantenendo l'integrità cellulare e rimuovendo i detriti subcellulari (Ravikumar B et al, 2010). In generale, l'autofagia gioca un ruolo cruciale nell'omeostasi cellulare e dei tessuti, così come nel regolare lo sviluppo di organismi e influenzare la patogenesi (Choi AMK et al, 2013). Essa è particolarmente richiesta nei periodi di digiuno, in mancanza di fattori di crescita e in condizioni di ipossia (He C and Klionsky DJ , 2009). È probabile che gli aminoacidi, prodotti di degradazione dell'autofagia, siano utilizzati per la sintesi de novo di proteine essenziali per fronteggiare la condizione di sofferenza, oltre che per mantenere stabile la produzione di ATP. Un ruolo importate dell'autofagia è, infatti, quello di mobilitare le risorge energetiche per far fronte alle esigenze metaboliche delle cellule e degli organismi (Lum et al., 2005; Levine e Kroemer, 2008); l'autofagia è importante per creare i metaboliti necessari a mantenere l'omeostasi energetica cellulare (Kuma et al. 2004).

L'autofagia partecipa al turnover dei mitocondri (attraverso un processo selettivo di mitocondrofagia) e di altri organelli oltre che all'eliminazione di aggregati proteicipoliubiquilati (strutture danneggiate) che si accumulano durante lo stress, l'invecchiamento o le malattie che causano una alterazione delle proteine (cancro, patologie neurodegenerative, infezioni). L'autofagia, quindi, svolge un ruolo protettivo, con funzioni di "pulizia" che includono l'eliminazione di proteine ed organelli difettivi, la prevenzione dell'accumulo di aggregati proteici anomali e la rimozione di patogeni intracellulari. Il meccanismo autofagico è l'unico in grado di degradare interi organelli come i mitocondri, i perossisomi, il reticolo endoplasmatico (Levine e Kroemer, 2008).

L'autofagia, inoltre, sembra sia coinvolta anche nel regolare il metabolismo dei lipidi (es. lipofagia) (Singh R, et al., 2009). L'autofagia può influenzare il controllo dell'infiammazione e del sistema immunitario. Ad esempio, durante una infezione, l'autofagia assiste la risposta immunitaria determinando la degradazione cellulare dei batteri e dei virus (es.xenofagia). Inoltre, essa può anche giocare un ruolo cruciale nella risposta immunitaria adattiva, come la risposta dell'antigene e lo sviluppo dei linfociti (Levine B, et al, 2011); può contribuire alla soppressione dell'infiammazione modulando, attraverso la conservazione della funzione mitocondriale, la risposta dell'organismo alle infezioni virali o all'invasione di patogeni (Nakahira K et al., 2011).

L'autofagia nel muscolo scheletrico

Nelle cellule eucariote, molte delle proteine sono degradate attraverso due sistemi proteolitici: ubiquitin-proteasoma e autofagia lisosoma. Nel muscolo scheletrico i due sistemi sono regolati in maniera coordinata e presentano distinte funzioni: i proteosomi degradano le miofibrille e la maggior parte delle proteine solubili a breve-vita (Clarke BA et al., 2007; Cohen S et al.,2009 ), mentre gli autofagi-lisosomi degradano le proteine a lunga-vita e gli organelli (Pallafacchina G et al, 2002) . In condizioni cataboliche, le proteine del muscolo sono mobilizzate per sostenere la glicogenesi nel fegato, per mantenere la sintesi delle proteine e per fornire substrati di energia per la conservazione di organi critici come il cuore, il cervello, il polmone e il fegato. Tuttavia, una eccessiva degradazione delle proteine nel muscolo scheletrico è altamente dannosa per l'economia del corpo umano e può condurre a morte. L'attivazione dell'autofagia nel muscolo scheletrico è stata descritta agli inizi degli anni 70 (Schiaffino S, Hanzlikova V, 1972), ma solo recentemente, grazie allo sviluppo di strumenti appropriati è stato possibile monitorare il processo autofagico e scoprire il suo importante ruolo nell'omeostasi muscolare (Klionsky DJ et al., 2008).

Si ritiene che l'autofagia abbia un duplice ruolo nell'omeostasi muscolare: può essere dannosa e può contribuire alla degenerazione muscolare, ma può essere anche un meccanismo compensatorio per la sopravvivenza cellulare. Ad esempio nella miopatia di Betlhlem e nella distrofia muscolare congenita di Ullrch, due disordini muscolari ereditari associati alla carenza del collageneVI, l'autofagia gioca un ruolo protettivo contro la debolezza e il deperimento muscolare e una inibizione del flusso autofagico determina un peggioramento della malattia (Bernardi and Bonaldo, 2008; Grumati et al., 2010). In molte miopatie si verifica un accumulo di autofagosomi e tale accumulo rappresenta la principale caratteristica di un gruppo di disordini muscolari chiamati miopatie autofagiche vacuolari, quali ad esempio la malattia di Pompe e la malattia di Danon (Malicdan et al., 2008). Il meccanismo patogenetico di queste miopatie è stato attribuito ad un'alterazione della funzione dei lisosomi. Recentemente è stata formulata un'altra ipotesi ovvero che l'evento primario che causa disorganizzazione delle miofibrlle ed alterazione nel traffico endocitotico sia l'accumulo massiccio di autofagosomi. Non risulta ancora chiaro però se l'accumulo di autofagosomi in queste miopatie contribuisce al danno muscolare o se, contrariamente, esso è un effetto compensatorio (Fukuda et al., 2006a; Fukuda et al., 2006b).

Infatti, l'inibizione del sistema autofagico in modelli animali della malattia di Pompe non migliora il fenotipo muscolare. Così, è stato ipotizzato che l'accumulo di autofagosomi, sebbene sia dannoso per la normale struttura dei sarcomeri ed alteri il traffico muscolare, può avere anche una funzione benefica: gli autofagosomi, inglobando e degradando le proteine e gli organelli danneggiati possono proteggere le miofibre dalla loro azione tossica (Sandri M, 2010). L' insieme dei risultati ottenuti da studi effettuati sia su muscoli normali che malati, indicano chiaramente che un appropriato bilanciamento del flusso autofagico è essenziale per mantenere un muscolo scheletrico sano, e che l'autofagia non bilanciata è un principale meccanismo patogenetico in molte malattie muscolari. Il flusso autofagico sembra essere una "lama a doppio taglio" molto critica per la funzione del muscolo. Troppa autofagia compromette l'omeostasi della miofibra, causando un'eccessiva rimozione delle componenti cellulari che sono necessarie per le normali attività e conducono all'atrofia muscolare quando l'eccessiva attività catabolica è sostenuta per lunghi periodi.

vie proteulitiche
Figura 15. Contributo delle vie proteolitiche all'atrofia muscolare durante condizioni cataboliche. In condizioni cataboliche, come la denervazione, il cancro, il digiuno, l'AIDS, e la sepsi, un programma di atrofia è attivato per degradare le proteine muscolari e gli organelli. I mitocondri, il reticolo endo/sarcoplasmatico sono inglobati dall'autofagosoma e consegnate ai lisosomi. Le proteine possono avere un duplice destino, essere riconosciute e rimosse dal proteasoma o ancorate all'autofagosoma. In quest'ultimo caso le catene di poliubiquitina interagiscono con il domain ubiquitin-legante di p62. Queste proteine hanno anche un domain per l'interazione con LC3 per cui le proteine ubiquilate sono portate al crescente autofagosoma.. Le linee tratteggiate rappresentano le azioni i cui meccanismi ed il ruolo nel muscolo devono essere definiti.

Ma anche un'insufficiente autofagia compromette l'omeostasi, conducendo all'accumulo di componenti cellulari danneggiate o non funzionanti, con compromissione strutturale e funzionale che causa una debolezza strutturale.

via indotta
Figura 16. Schema della via indotta dall'inibizione dell'autofagia. Durante le condizioni fisiologiche, gli autofagosomi rimuovono i mitocondri danneggiati, le proteine alterate, le protein non-piegate che sono inclini ad aggregarsi, controllano la qualità del processo di piegatura nel reticolo endoplasmatico e influenzano la stabilità del DNA. Quando l'autofagia è carente mitocondri anormali iniziano ad accumularsi, rilasciano fattori pro-apoptotici e producono specie reattive d'ossigeno (ROS) che danneggiano le proteine e il DNA. Le proteine danneggiate, mal piegate o non-piegate possono avere due destini, essere riconosciuti e rimossi dal proteosoma o ancorati all'autofagosoma.Quando l'autofagia è bloccata, le catene di poliubiquitina interagiscono con il domain legante l'ubiquitina della proteina p 62 che oligomerizza, risultando in aggregati di proteina ubiquitin-positiva. L'accumulo di aggregati può essere tossico per i mitocondri, il reticolo endoplasmatico e le funzioni nucleari. Una mancanza dell'autofagia influenza la qualità del controllo della sintesi della proteina e induce una risposta non-piegata della proteina. Le linee tratteggiate rappresentano le azioni potenzialmente tossiche di aggregate I cui meccanismi molecolari e il cui ruolo nel muscolo scheletrico adulto non sono ancora definite.

Considerato il ruolo patogenetico in alcune malattie muscolari, è anche concepibile che un leggero e cronico sbilanciamento del processo autofagico possa contribuire significativamente alla sarcopenia, l'eccessiva perdita di massa muscolare che si verifica nella vecchiaia. Una anormale regolazione dell'autofagia negli individui anziani, potrebbe interferire con le proprietà contrattili delle miofibre e renderle meno stabili e più suscettibili ai danni indotti dalla contrazione, conducendo eventualmente all'atrofia muscolare (Cuervo, 2008).