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Discussione e conclusioni

Discussione, autofagia e mitofagia, vie del segnale e stress cellulare, conclusioni

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Discussione e conclusioni

Discussione

In questo studio gli autori hanno dimostrato che effettuare un esercizio di endurance a bassa intensità dopo una notte di digiuno causa un aumento dell'autofagia nel muscolo scheletrico di entità maggiore di quello che si verifica nei topi che effettuano lo stesso esercizio ma in una condizione di sazietà. Questo maggiore aumento dell'autofagia sembra essere mediato dalla via insulina/Akt/mTOR e da i suoi target a valle FoxO3a e ULK1.

Autofagia e mitofagia

Novanta minuti di un esercizio di endurance a bassa intensità nella condizione di sazietà ha chiaramente aumentato LC3b-II e quindi la presenza di autofagosomi nella cellula. I risultati di questo esperimento sono in accordoq con quelli riportati da Grumati et al. (Grumati P. et al., 2011) e da He et al. (He C, et al., 2012), ma differiscono da quelli di Kim et al (Kim YA, et al., 2012) che, invece, evidenziavano un livello di LC3b-II non cambiato. Il livello stabile di p62/SQSTM1, rilevato nell'esperimento, fa suggerire agli autori che la degradazione lisosomiale di AP non era (già) attivata alla fine dell'esercizio quando questo era effettuato nella condizione di sazietà. Quando l'esercizio era condotto nella condizione di digiuno, LC3b-II era ulteriormente aumentato. Il trend decrescente di p62/SQSTM1 combinato con la significativa alterazione di alcuni markers dell'autofagia – es. Gabarapl1-I, il rapporto Gabarapl1-I/II, cATG12, così come p62, lc3b e gabarapl1- sono argomenti a favore di un più alto flusso autofagico. Presi insieme, questi risultati mostrano che gli effetti combinati di digiuno ed esercizio conducono ad una più alta attivazione dell'autofagia nel muscolo scheletrico. Se però il digiuno e l'esercizio abbiano sempre effetti additivi nell'attivazione dell'autofagia, è stato difficile da valutare. Un enorme aumento di LC3b-II (120 volte) è stato osservato nei muscoli plantari di ratti dopo 3 giorni di digiuno (Ogata T, et al., 2010). In questa condizione, è improbabile che l'aumento di quattro volte, osservato nel presente studio dopo l'esercizio di endurance, possa avere una significativa influenza sull'attivazione dell'autofagia.

L'aumento del volume dei mitocondri è essenziale per l'incremento della capacità ossidativa del muscolo, ma un'efficiente rimozione dei mitocondri disfunzionali sembra essere cruciale per sostenere un'ottimale respirazione mitocondriale nel muscolo scheletrico. Benché, finora, la maggior attenzione è stata data alla biogenesi mitocondriale, attualmente sta avanzando l'idea (e si stanno producendo evidenze) che anche il rimodellamento della rete mitocondriale (processi di scissione e di fusione) e la mitofagia contribuiscano ai benefici che l'esercizio determina sulla salute muscolare (Yan Z, et al. 2012).

Nell'esperimento presentato, la scissione è sembrata essere inversamente controllata dall'esercizio e dal digiuno. Il digiuno ha represso l'espressione di Drp1 mRNA, una regolazione che va contro il processo di scissione. Al contrario, l'esercizio regola positivamente l'inizio della scissione aumentando lo stato di fosforilazione di DRP1Ser616. Questo conferma le precedenti osservazioni che gli autori hanno effettuato sugli esseri umani che si allenano (Jamart C, et al., 2012). Nell'esperimento presentato, lo stato nutrizionale non ha regolato lo stato di fosforilazione di DRP1 dimostrando che per indurre la scissione, un processo che probabilmente partecipa al rimodellamento della rete mitocondriale, è richiesto l'esercizio e il solo digiuno non è sufficiente. L'aumentata scissione mitocondriale è stata supposta sia una premessa alla mitofagia (Twig G, et al., 2008). Le proteine chiave che regolano la mitofagia sono BNIP3, Parkin, e p62/SQSTM1 (Romanello V e Sandri M., 2013). In un precedente studio, gli autori non avevano osservato alcun cambiamento nel livello delle proteine BNIP3 e Parkin in risposta all'esercizio di ultraendurance nel muscolo scheletrico umano (Jamart C, et al., 2012). In questo esperimento, entrambi Parkin e BNIP3 erano aumentati a seguito del digiuno e questo aumento era completamente scomparso dopo l'esercizio. Queste osservazioni suggeriscono che la mitofagia era attivata durante l'esercizio nella condizione di digiuno. Poiché Parkin e BNIP3 sono ancorati alla membrana mitocondriale, il loro ritorno al livello basale dopo l'esercizio condotto nella condizione di digiuno è probabilmente dovuto a un aumento del flusso mitofagico, con conseguente degradazione di queste proteine insieme ai mitocondri. La più alta espressione mRNA di Bnip3 e della fosforilazione di DRP1, così come il più basso livello di p62/SQSTM1 nel gruppo Digiuno + Corsa, in confronto al gruppo Digiuno + Riposo, sono altri elementi a favore di questa ipotesi.

Il protocollo di esercizio utilizzato nell'esperimento ha attivato il principale regolatore della biogenesi mitocondriale Pgc1a, ma i markers di fusione Mfn1 e Mfn2 sono rimasti inalterati. Altri autori usando un protocollo di esercizio incrementale nei ratti avevano riportato una diminuzione di Mfn1 e Mfn2 mRNA durante l'esercizio e un aumento nelle ore successive alla fine dell'esercizio (Ding H, et al., 2010). Questo suggerisce che la fusione mitocondriale è repressa o non è cambiata durante l'esecuzione dell'esercizio ed è attivata nella fase di recupero.

Se un'aumentata mitofagia contribuisca a un più favorevole rimodellamento dei mitocondri, che dovrebbe essere di beneficio per il muscolo, rimane sconosciuto ma evidenze sperimentali supportano questa ipotesi. I topi carenti di PINK, incapaci di attivare la mitofagia, mostrano una profonda disfunzione mitocondriale nel muscolo scheletrico. Al contrario, fare un esercizio in una condizione di digiuno determina un miglioramento maggiore nel metabolismo dei grassi e nel processo ossidativo rispetto a quello che si verifica quando lo stesso programma viene effettuato in una condizione di sazietà (Van Proeyen K, et al., 2011). Chiaramente, se ulteriori ricerche saranno capaci di confermare questa ipotesi, fare esercizio in una condizione di digiuno potrebbe rivelare un efficiente paradigma di esercizio per la lotta contro le deleterie conseguenze metaboliche di malattie come l'obesità e l'insulino-resistenza.

Vie del segnale e stress cellulare

L'attivazione dell'autofagia in risposta all'esercizio di endurance è correlata alle sue principali funzioni omeostatiche, vale a dire: 1) fornire energia alternativa al substrato e, 2) rimuovere i costituenti danneggiati della cellula (Levine B and Kroemer G, 2008). I risultati dell'esperimento presentato, sostengono l'idea che endurance running a bassa intensità, aumenta l'autofagia in una maniera insulino/Akt/mTOR/ULK1-dipendente. Eseguire lo stesso esercizio in una condizione di digiuno, ha determinato un ulteriore aumento dell'autofagia, attraverso l'attivazione di FoxO3a.

L'attività di ULK1 è sotto il controllo sia di mTORC1 che di AMPK (Kim J, et al., 2011). mTORC1 previene l'attivazione di ULK1 fosforilando la chinasi a Ser575 (Kim J, et al., 2011). In condizioni di bassa energia, mTORC1 si dissocia da ULK1, e quest'ultimo fosforila Atg13 e FIP200 con conseguente attivazione dell'autofagia (Zhao M and Klionky DJ, 2011). Al meglio delle loro conoscenze gli autori ritengono che questo loro è il primo studio che riporta una de-fosforilazione di ULK1Ser575 ed un aumento nella forma totale di ULK1 nel muscolo scheletrico in risposta all'esercizio.

AMPK è anche abile a controllare l'attività di ULK1 sia direttamente, fosforilando la chinasi in molteplici siti, sia indirettamente inibendo mTORC1 (Egan D, et al., 2011; Sanchez AM, et al, 2012a; Sanchez AM, et al, 2012b). Tuttavia, lo stato di fosforilazione di AMPThr172 è rimasto inalterato in tutte le condizioni sperimentali utilizzate. I risultati di questo studio sono in accordo con precedenti studi che hanno mostrano che non si verifica, a seguito di un esercizio di endurance a bassa intensità, alcuna alterazione dello stato di fosforilazione o dell'attività di AMPKa (Egan B, et al., 2010; Gonzalez AA, et al., 2004; Tadaishi M, et al., 2011). Nell'esperimento, lo stato di fosforilazione, dei siti AMPK-dipendenti di ULK1 (Ser317 e Ser555), non è risultato modificato. Inoltre, secondo gli autori, i loro risultati suggeriscono che AMPK non era essenziale per l'attivazione del complesso ULK1. Questa attivazione, nelle condizioni dell'esperimento, è stata determinata piuttosto dall'inibizione di mTORC1.

FoxO3a è il principale regolatore trascrizionale dell'autofagia nel muscolo scheletrico (Mammucari C, et al., 2007; Zhao J, et al., 2007), la cui localizzazione nucleare è regolata principalmente dal suo stato di fosforilazione (Van Der Heide LP, et al., 2004). Nell'esperimento presentato, FoxO3aThr32 era più basso quando l'esercizio era condotto in una condizione di digiuno e questa diminuzione era associata ad una più alta espressione dei target trascrizionali di FoxO3a, come Lc3b e Gabarapl1. Presi insieme, questi dati supportano l'idea che l'esercizio in una condizione di digiuno aumenti ulteriormente l'autofagia attraverso regolazioni trascrizionali mediate da FoxO3a. Tuttavia ulteriori esperimenti sulla perdita delle funzioni consentirebbero di determinare chiaramente la funzione di FoxO3a nella regolazione dei geni correlati all'autofagia. Altre vie del segnale hanno potenzialmente contribuito all'aumento di LC3b-II in risposta all'esercizio di endurance.

He et al. hanno mostrato che l'interruzione dell'interazione tra B-cell lymphoma2 (Bcl-2) e Beclin-1 tiene conto dei benefici metabolici dell'attivazione dell'autofagia in risposta all'esercizio (He C, et al., 2012). L'interazione tra Bcl-2 e Beclin-1 è regolata da alcuni meccanismi. La fosforilazione di Bcl-2 attraverso c-jun NH2-terminal (JNK) MAPK (Wel Y, et al., 2008) è un'ipotesi attraente poiché è noto che i MPAK sono regolati dall'esercizio (Kramer HF and Goodvear LJ, 2007). Gli sperimentatori hanno misurato lo stato di fosforilazione di JNK a Thr183/Tyr185 ed hanno rilevato che esso è rimasto inalterato (dati non mostrati). BNIP3 può competere con Beclin-1 legando Bcl-2 attraverso i loro BH3 domain. Pertanto, secondo gli autori, l'aumento di BNIP3 nel gruppo Digiuno+Riposo potrebbe spiegare il più alto LC3b-II attraverso l'interruzione della interazione Bcl-2/Beclin-1.

Un'altra kinasi che, è noto, regola l'autofagia nel muscolo scheletrico è p38MAPK (Doyle A, et al., 2011; McClung JM, et al., 2010). La fosforilazione di p38 aumenta in una varietà di stress cellulari incluso l'esercizio (25) e la starvazione (Kim J, et al., 2009). Gli sperimentatori hanno misurato un significativo aumento di p38Thr180/Tyr182 nei gruppi Sazietà+Corsa e Digiuno+Riposo, ma nessun ulteriore aumento quando l'esercizio era combinato con il digiuno. Mentre il coinvolgimento di p38 nell'espressione del gene correlato all'autofagia e la presenza di AP sono state già evidenziate (Doyle A, et al., 2011; McClung JM, et al., 2010), il suo ruolo e le vie del segnale implicate non sono state ancora completamente chiarite. E' possibile che p38 lega lo stress ossidativo all'autofagia (McClung JM, et al., 2010). Tuttavia, gli sperimentatori in questo studio non hanno rilevato alcun aumento dei carbonili proteici. L'autofagia è plausibilmente up-regolata a seguito dello stress del Reticolo Endoplasmatico (ER) per aiutare la rimozione di proteine mispiegate o non piegate. L'UPR induce autofagia controllando la trascrizione di vari Atg (Deegan S, et al., 2012). Per esempio, il fattore di trascrizione ATF4 provoca l'espressione di LLC3 e Atg12 (Kouroku Y et al., 2007; Rouschop KM, et al., 2010). Secondo gli autori, i loro risultati indicano che ATF4 contribuirebbe all'attivazione dell'autofagia durante l'esercizio indipendentemente dallo stato nutrizionale, ma ATF4 non è un marker specifico di UPR dato che altri meccanismi regolatori della trascrizione di ATF4 sono stati descritti (Dey S, et al., 2010). Anche l'osservata attivazione di eIF2a, durante l'esercizio nella condizione di sazietà, secondo gli autori è a favore dell'implicazione dello stress di ER nella conversione di LC3 durante l'esercizio (Kouroku Y et al., 2007). Inaspettatamente per gli autori, eIF2aSer51, CHOP e XBP1s sono rimasti inalterati quando l'esercizio era condotto nella condizione di digiuno, e questo loro ritengono sia una dimostrazione che in questa circostanza, lo stress ER non è attivato dall'esercizio e quindi non può contribuire all'attivazione dell'autofagia. I meccanismi responsabili dell'attivazione di UPR durante l'esercizio nella condizione di digiuno sono attualmente sconosciuti.

Conclusioni

Dalle più recenti evidenze scientifiche prese in esame in questa tesi emergono diversi aspetti:

  • In primo luogo viene evidenziato come l'esercizio di Endurance a bassa intensità dopo una notte di digiuno, sia più efficace nell'aumentare l'autofagia nel muscolo scheletrico, rispetto ad uno stesso esercizio condotto in condizioni di sazietà. Questo maggiore aumento dell'autofagia, sembra essere mediato dalla via insulina/Akt/mTOR e dai suoi target a valle FoxO3a e ULK1. Infatti, quando l'esercizio è condotto in una condizione di digiuno, LC3b-II aumenta, PS2/SQSTM1 ha un trend decrescente e si ha un'alterazione di alcuni markers dell'autofagia (ad esempio Gabarapl1-I). Questi dati confermano che gli effetti combinati del digiuno ed esercizio conducono ad una più alta attivazione dell'autofagia nel muscolo scheletrico.
  • Dai risultati dello studio presentato si evidenzia che effettuare esercizi di endurance running a bassa intensità, aumenta l'autofagia in una maniera insulino/Akt/mTOR/ULK1-dipendente. In aggiunta a ciò, si è notato che effettuare lo stesso esercizio, in condizioni di digiuno aumenta ulteriormente l'autofagia attraverso regolazioni trascrizionali mediate da Fox03a (principale regolatore dell'autofagia nel muscolo scheletrico).
  • Il rimodellamento della rete mitocondriale (processi di scissione e fusione) e la mitofagia, contribuiscono ai benefici che l'esercizio determina sulla salute muscolare: Drp1 mRNA, che determina la regolazione della scissione mitocondriale, viene repressa dal digiuno; al contrario, l'esercizio fisico regola positivamente l'inizio della scissione aumentando lo stato di fosforilazione di Drp1. Da ciò ne consegue che per indurre la scissione è necessario l'esercizio, poiché il solo digiuno non è sufficiente. E' stato supposto che l'aumentata scissione mitocondriale, possa essere una premessa della mitofagia. Dal momento che Parkin e BNIP3 (proteine chiave che regolano la mitofagia) sono aumentati a seguito del digiuno, ma poi questo aumento è scomparso dopo l'esercizio fisico, ciò suggerisce che la mitofagia è attiva durante l'esercizio in condizioni di digiuno.
  • Un'altra evidenza mostra che la fusione mitocondriale è repressa, o non cambia, durante l'esecuzione dell'esercizio; ma viene attivata solo durante la fase di recupero.

Svolgere un esercizio in condizioni di digiuno determina un miglioramento maggiore nel metabolismo dei grassi e nel processo ossidativo, rispetto a svolgere lo stesso esercizio in condizioni di sazietà. Ciò potrebbe rivelare un efficiente programma di esercizio per la lotta contro le patologie metaboliche come l'obesità e l'insulino resistenza.